腺相關(guān)病毒 (AAV) 是基因治療中最廣泛使用的傳遞/遞轉(zhuǎn)機(jī)制。近年來，基于AAV病毒所開發(fā)的基因療法研發(fā)及臨床試驗(yàn)注冊(cè)數(shù)量也呈指數(shù)級(jí)增長(zhǎng)，也需要AAV病毒生產(chǎn)工藝及產(chǎn)能的不斷優(yōu)化及擴(kuò)展，從最早基于貼壁細(xì)胞工藝升級(jí)轉(zhuǎn)換到以懸浮為主的200-2000L反應(yīng)體系。

Mirus Bio成立于1996年，在核酸遞送領(lǐng)域深耕多年，于2021年8月推出GMP級(jí)別TransIT-VirusGEN® GMP 轉(zhuǎn)染試劑，支持AAV及LV從科研到GMP商業(yè)化生產(chǎn)。不同于傳統(tǒng)基于單組分的轉(zhuǎn)染試劑(如陽離子聚合物聚乙烯亞胺，PEI)，Mirus Bio將專利的多聚物及脂質(zhì)技術(shù)進(jìn)行多重組合，形成多功能性的轉(zhuǎn)染方案，克服細(xì)胞遞轉(zhuǎn)過程中的多重阻礙，以實(shí)現(xiàn)更高效轉(zhuǎn)染和更低細(xì)胞毒性，從而大幅度提升多種血清型AAV病毒生產(chǎn)載量。去年7月底Mirus上市RevIT? AAV Enhancer，已證明在不同AAV血清型別中，可提高AAV病毒基因組滴度1.2-4.9倍，并且在一定程度改善了實(shí)心率。更重要的是，RevIT? AAV Enhancer不僅可以搭配Mirus TransIT-VirusGEN® GMP 轉(zhuǎn)染試劑，也適配于其他轉(zhuǎn)染試(如PEI等)，使得AAV生產(chǎn)上游成本的進(jìn)一步降低成為可能，進(jìn)而降低了基因治療單劑量成本。下圖展示了國(guó)內(nèi)客戶前期測(cè)試反饋結(jié)果，測(cè)試包括了不同血清型別的質(zhì)粒設(shè)計(jì)，適用于國(guó)內(nèi)及國(guó)外品牌的轉(zhuǎn)染試劑、細(xì)胞及培養(yǎng)基體系，實(shí)現(xiàn)了1.5-4倍以上的AAV病毒滴度提升。

RevIT Enhancer在國(guó)內(nèi)客戶不同AAV項(xiàng)目平臺(tái)上的測(cè)試反饋結(jié)果

隨著國(guó)內(nèi)外客戶項(xiàng)目及管線推進(jìn)，已有越來越多的客戶將TransIT-VirusGEN® 轉(zhuǎn)染試劑以及RevIT? AAV Enhancer從搖瓶階段線性放大至200L-500L反應(yīng)器，并且已應(yīng)用到處于臨床申報(bào)產(chǎn)品中。ReciBioPharm 與Mirus Bio合作， Chris Brown(工藝流程開發(fā)部門)在線上(鏈接)展示了TransIT-VirusGEN 和RevIT? AAV Enhancer數(shù)據(jù)結(jié)果，并且比較了所有測(cè)試規(guī)模(搖瓶&反應(yīng)器)，反饋病毒滴度放大效果非常好，并且實(shí)心率也保持相同水平，在 50 升的生物反應(yīng)器中，也有著40%以上實(shí)心率。Chris Brown表示“選擇用TransIT-VirusGEN 和RevIT? AAV Enhancer產(chǎn)品，是基于我們以往的測(cè)試數(shù)據(jù)，允許最大限度地提高 AAV 產(chǎn)量。產(chǎn)量的提高，單個(gè)50 升生物反應(yīng)器可生產(chǎn)更多劑量，從而降低單位劑量的成本。”

更多的，Bridgebio在poster中分享了基于AAV5型別，使用TransIT-VirusGEN® 轉(zhuǎn)染試劑以及RevIT? AAV Enhancer從搖瓶線性放大至200L反應(yīng)體系(125mL搖瓶→2L → 10L → 200L)，病毒滴度和實(shí)心率數(shù)據(jù)結(jié)果(圖1)。與原有工藝相比 (Process A：PEIPro轉(zhuǎn)染 + Expi293細(xì)胞/培養(yǎng)基)，替換成TransIT-VirusGEN® 轉(zhuǎn)染試劑后的工藝流程 (Process B：TransIT-VirusGEN® 轉(zhuǎn)染試劑 + Expi293細(xì)胞 + BalanCD培養(yǎng)基；Process C：TransIT-VirusGEN® 轉(zhuǎn)染試劑 + VP2.0細(xì)胞 + BalanCD培養(yǎng)基)均有著更高的病毒滴度(圖2)和更低的宿主DNA和質(zhì)粒DNA殘留。

圖1. 從125mL搖瓶線性放大至200L反應(yīng)體系的病毒滴度和實(shí)心率數(shù)據(jù)結(jié)果

圖2. 采用Mirus的工藝平臺(tái)均有著更高的病毒滴度

Mirus Bio 并沒有止步于此，并于2024年10月7日重磅推出 TransIT®-AAViator AAV轉(zhuǎn)染試劑。繼續(xù)沿用Mirus Bio 多聚物及脂質(zhì)兩組分的經(jīng)典組合，不同的是應(yīng)用逆向工程思維，基于現(xiàn)有RevIT? AAV Enhancer，從Mirus Bio多聚物及脂質(zhì)庫中，分別篩選出更優(yōu)化的脂質(zhì)和聚合物配方。新推出的TransIT®-AAViator轉(zhuǎn)染體系，進(jìn)一步降低了 AAV工藝生產(chǎn)流程中所需質(zhì)粒 DNA 和轉(zhuǎn)染試劑使用量，最大限度地提高不同AAV血清型滴度和實(shí)心率，從而提升 AAV生產(chǎn)工藝的總體生產(chǎn)效率。整合TransIT®-AAViator的AAV病毒上游生產(chǎn)工藝，無需通過細(xì)胞密度而調(diào)整試劑和質(zhì)粒DNA加入量，并且實(shí)現(xiàn)了單個(gè)生物反應(yīng)器的生產(chǎn)劑量的成倍增加，大幅度降低了單位劑量的成本，為基于AAV 病毒的基因治療開發(fā)提供了更優(yōu)的解決方案。

產(chǎn)品詳情

• 產(chǎn)品名稱: TransIT®-AAViator Transfection System
• 上市日期：2024年10月7日
• 產(chǎn)品貨號(hào): MIR 73750 / MIR 73745
• 產(chǎn)品組分：TransIT®-AAViator轉(zhuǎn)染試劑及RevIT? AAV增強(qiáng)子

Mirus Bio AAV病毒生產(chǎn)相關(guān)轉(zhuǎn)染試劑產(chǎn)品參數(shù)

* HDPE材質(zhì)管/瓶

*只針對(duì)30 mL以及150 mL 規(guī)格試劑

**只針對(duì)150 mL 規(guī)格試劑

TransIT-AAViator®提升AAV生產(chǎn)效率&降低單劑量成本

生產(chǎn)劑量的成倍增加

隨著AAV病毒滴度的提升，單個(gè)反應(yīng)器所允許生產(chǎn)劑量也成倍的增加，從而大幅度降低單劑量成本。

減少生產(chǎn)所需批次

提高AAV病毒生產(chǎn)總產(chǎn)量，減少每次生產(chǎn)的所需批次數(shù)量或擴(kuò)大生物反應(yīng)器規(guī)模才可滿足生產(chǎn)需求，緩解了由于產(chǎn)能不足等諸多限制。

減少質(zhì)粒DNA用量

TransIT®-AAViator 轉(zhuǎn)染系統(tǒng)，降低了至少一半質(zhì)粒 DNA使用量 ，同時(shí)仍可保持高水平的滴度和實(shí)心率，進(jìn)一步降低了批次生產(chǎn)成本。

加快工藝開發(fā)進(jìn)程

TransIT®-AAViator 轉(zhuǎn)染系統(tǒng)，只需較少實(shí)驗(yàn)優(yōu)化，即可獲得最佳結(jié)果，從而縮短了工藝開發(fā)時(shí)間，加快了產(chǎn)品上市速度。

TransIT®-AAViator有著更高滴度和實(shí)心率

使用不同的質(zhì)粒設(shè)計(jì)(GFP基因-圖3；RPE65 基因-圖4)，平行比較TransIT®-AAViator 轉(zhuǎn)染系統(tǒng)與“Poly F”(Polyplus FectoVIR® 病毒轉(zhuǎn)染試劑)以及“Poly P” (Polyplus PEIpro®病毒轉(zhuǎn)染試劑)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在不同AAV血清型別中 (AAV5、8、9)，TransIT®-AAViator 轉(zhuǎn)染系統(tǒng)有著更高的病毒滴度及實(shí)心率，當(dāng)質(zhì)粒設(shè)設(shè)計(jì)替換成治療性基因(RPE65 基因)，病毒滴度及實(shí)心率相比于競(jìng)爭(zhēng)品牌，其優(yōu)勢(shì)更加顯著。

圖3. 轉(zhuǎn)染GFP基因質(zhì)粒的AAV滴度

圖4. 轉(zhuǎn)染RPE65基因質(zhì)粒的AAV滴度

TransIT®-AAViator降低質(zhì)粒DNA用量

TransIT®-AAViator轉(zhuǎn)染系統(tǒng)，在較低質(zhì)粒 DNA 用量仍可得到高水平AAV病毒滴度及實(shí)心率（圖5）。

圖5. 實(shí)驗(yàn)使用TransIT® -AAViator轉(zhuǎn)染試劑(試劑:DNA比例為1.25:1,vol:wt)，以 1:1:1 的質(zhì)粒質(zhì)量比轉(zhuǎn)染 pAAV-WPRE-GFP (Aldevron), pAAV-Helper (Aldevron) 和 pAAV-RepCap (AAV9 Genemedi)三質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染時(shí)加入RevIT AAV Enhancer（1 μl/mL），轉(zhuǎn)染后 72 小時(shí)使用化學(xué)裂解法收獲 AAV病毒。

TransIT-AAViator實(shí)驗(yàn)流程

Step 1:  轉(zhuǎn)染前，需保證生長(zhǎng)在培養(yǎng)基中的懸浮 HEK 293 細(xì)胞活率 > 95%。

Step 2: 轉(zhuǎn)染時(shí)：建議細(xì)胞密度為 ~ 3 × 10E6 cells/mL，TransIT®- AAViator 試劑與DNA 加入比例為1:1 - 1.5:1，每 1 mL 培養(yǎng)基加入RevIT AAV Enhancer 0.5 - 1.5 μl；靜止條件下孵育15-45 分鐘，以便形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物，然后輕柔的加入細(xì)胞中。

Step 3: 轉(zhuǎn)染后無需更換培養(yǎng)基，一般可在轉(zhuǎn)染后 48-72 小時(shí)收獲AAV病毒。

客戶案例分享

最新線上webinar：Enhancing AAV Production: A Novel Transfection System for Cell and Gene Therapy Applications (鏈接)

演講者信息：

Webinar內(nèi)容一覽：

通過該線上Webinar，可了解TransIT®-AAViator 轉(zhuǎn)染系統(tǒng)，包括了開發(fā)初衷、數(shù)據(jù)性能對(duì)比及展示等。來自Affinia Therapeutics 高級(jí)工藝開發(fā) Michael White， 強(qiáng)調(diào)了該轉(zhuǎn)染系統(tǒng)的可擴(kuò)展性和工作流程的易整合性，是想要優(yōu)化上游工藝和增加整體成本效益的理想選擇。

此外，Michael White分享了 Affinia Therapeutics AAV轉(zhuǎn)染平臺(tái)體系納入TransIT®-AAViator 轉(zhuǎn)染系統(tǒng)經(jīng)驗(yàn)，強(qiáng)調(diào)該系統(tǒng)能夠降低質(zhì)粒DNA用量，同時(shí)也在不同規(guī)模中進(jìn)行了測(cè)試(搖瓶-3L反應(yīng)器)，可穩(wěn)定的保持高水平滴度，從而大幅度提高了生產(chǎn)工藝的效率，同時(shí)降低了AAV病毒生產(chǎn)成本。

討論重點(diǎn)包括：

• Affinia 比較了新一代轉(zhuǎn)染系統(tǒng)TransIT®-AAViator與當(dāng)前使用的平臺(tái)工藝；
• Affinia 在將TransIT-AAViator® 與其他試劑性能進(jìn)行比較中，如何優(yōu)化使其性能顯著優(yōu)于其他轉(zhuǎn)染試劑；
• 整合TransIT®-AAViator轉(zhuǎn)染系統(tǒng)，相比于優(yōu)化前實(shí)現(xiàn)了3 倍滴度提升及 70% 實(shí)心率。

小結(jié)

新一代專為優(yōu)化AAV 生產(chǎn)工藝而推出的轉(zhuǎn)染試劑: TransIT®-AAViator 轉(zhuǎn)染系統(tǒng)：

• 與基于單個(gè)組分(如PEI)轉(zhuǎn)染試劑不同，可顯著的提高不同AAV 血清型別的滴度及實(shí)心率；
• 有著更低轉(zhuǎn)染試劑及質(zhì)粒DNA使用量需求，同時(shí)保持高水平的AAV滴度及實(shí)心率；
• 相比于競(jìng)爭(zhēng)品牌(FectoVIR&PEIpro等)，有著更高基因組滴度及實(shí)心率，并且質(zhì)粒設(shè)計(jì)為治療基因，其優(yōu)勢(shì)更加顯著。

相關(guān)產(chǎn)品信息及鏈接

Mirus成立于1995年，始終秉承著為基因遞轉(zhuǎn)提供優(yōu)化方法及高效的工具。憑借超過 25 年轉(zhuǎn)染領(lǐng)域的深根細(xì)作，獲得了多項(xiàng)技術(shù)突破，已成為核酸遞送領(lǐng)域的全球領(lǐng)導(dǎo)者和值得信賴的品牌。Mirus科學(xué)家團(tuán)隊(duì)不斷突破轉(zhuǎn)染技術(shù)的極限，推出了VirusGEN®轉(zhuǎn)染試劑與RevIT?增強(qiáng)劑，進(jìn)一步提升AAV/LV產(chǎn)量，助力推動(dòng)生物治療藥物的降本增效，為CGT領(lǐng)域客戶賦能。

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